Évaluation pharmacodynamique et sécurité d'emploi de l'Époétine alfa chez les patients aux soins intensifs

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation phénotypique et génotypique d’isolats de Salmonella Typhimurium provenant de porcs sains ou septicémiques

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.

Rôle de MTORC2 dans la sénescence et la différenciation myofibroblastique induites par l'autophagie

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique.

Caractérisation et surexpression des fimbriae de type chaperon-placier de Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain.

Dissection moléculaire de la sénescence cellulaire induite par le stress et la thérapie dans le cancer de l’ovaire et son impact sur la réponse des patientes

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.